Влияние режима оттаивания на качественные характеристики семени быков-производителей.

Авторы: Комбарова Н.А., к.б.н., главный технолог АО «ГЦВ»,
Корнеенко-Жиляев Ю. А., к.б.н.,  ООО «Венера-Вет»,
Клинникова С.В., технолог АО «ГЦВ»

Эффективное ведение племенной работы на современном этапе невозможно без применения метода искусственного осеменения сельскохозяйственных животных.

Разбавление спермы и уменьшение дозы для осеменения ведут к тому, что в половые пути самки попадает ограниченное количество сперматозоидов, что повышает требования к их качеству.

Большое значение для сохранения оплодотворяющей способности сперматозоидов после оттаивания имеет температурно-скоростной режим их оттаивания, хотя по этому вопросу до сих пор нет единого мнения.

Известно, что гибель половых клеток в большей степени вызвана не криоконсервацией, а непосредственно процедурой оттаивания. В первую очередь, это связано с формированием кристаллов внутриклеточного льда, повреждающих клетку при перекристаллизации. При оттаивании спермы до -20 ºС нагревание, независимо от скорости притока тепла, идет почти одинаково и очень быстро. Затем наступает некоторая задержка подъема температуры, длительность которой обусловлена скоростью подвода тепла. Следовательно, чем выше температура водяной бани, тем короче пауза задержки подъема температуры в оттаиваемом объекте.

Если рассмотреть применяемые методы оттаивания криоконсервированной спермы в водяной бане, то можно выделить два основных способа. Необлицованные гранулы из азота переносятся непосредственно в жидкую среду. Подвод температуры в жидкой среде более равномерен, чем в воздушной. Отделение фракций спермы в процессе оттаивания происходит в разбавитель, основу которого составляет буфер, что частично предохраняет сперматозоиды от осмотических повреждений.

Соломинки и облицованные гранулы при оттаивании полностью погружаются в водяную баню. В данном случае спермодозы запаяны герметично, поэтому при медленной скорости подвода тепла к оттаиваемому объекту возникает больше возможности осмолярных повреждений, однако при слишком быстром подводе тепла возможен риск гипотонических повреждений из-за быстрого таяния внеклеточного льда.

Было интересно изучить качественные характеристики семени замороженного в соломинках, такие как подвижность, скорость движения, переживаемость в зависимости от экспозиции и различного температурного режима водяной бани.

Эксперимент был проведен в лаборатории ОАО «ГЦВ» на криоконсервированной в полипропиленовых соломинках сперме от 3-х импортных быков-производителей голштинской породы в возрасте 4-5 лет. Фасовку и замораживание проводили на технологической линии IMV(Франция) с безжелточным разбавителем optiXсell (Франция).

При оттаивании быстро по одной извлекали из тубы стерильным, предварительно охлажденным в азоте пинцетом полипропиленовые соломинки, встряхивали 1-2 секунды и погружали в водяную баню при различных температурных режимах 35, 38, 50, 70 ºС в течение 30, 10, 5, и 3 секунд, соответственно. В продолжение всего времени оттаивания соломинку перемещали круговыми движениями.

Затем соломинки извлекали из водяной бани и, тщательно осушая марлевой салфеткой, обрезали запаянный кончик ножницами, промеряли температуру внутри соломинки с помощью термопары, затем содержимое путем нажатия поршня на полипропиленовую пробку выдавливали в теплый пенициллиновый флакон, содержащий 0,8 мл безжелточного разбавителя optiXсell (Франция).

В каждой серии опыта от трех быков были оттаяны по 2 дозы замороженного семени в соломинках в объеме 0,25 мл при разных температурных режимах водяной бани. Всего было исследовано 72 дозы семени.

Подвижность половых клеток изучали в световом микроскопе при увеличении 150 раз, препарат при микроскопии располагали на термостолике, подогретом до t +38 ºС. Параллельно проба из этого же образца была исследована и в спермоанализаторе SFA-500. После первичной оценки проводили in vitro тест для определения жизнеспособности сперматозоидов путем инкубирования в термостате при температуре +38 ºС в течение 5, 20 и 24 часов.

Учитывали следующие показатели: общая подвижность (%), из них быстроподвижных %, скорость движения мкм/секунду и число сперматозоидов с прямолинейно поступательным движением (ППД) на разных сроках инкубации.

Выяснили, что независимо от температуры водяной бани при правильно подобранной экспозиции (время оттаивания) во всех случаях температура семени внутри соломинок после оттаивания составила +25 ºС±0,4.

*Р<0,001

Из данных, приведенных в таблице 1, видно, что при микроскопии существенной разницы по подвижности сперматозоидов сразу после оттаивания образцов, независимо от температурного режима водяной бани, не имеется и варьируется в диапазоне 35-38 %, в анализаторе получены сходные результаты в диапазоне 34,4-36,5%, данные недостоверны.

Процент быстро подвижных сперматозоидов при всех режимах оттаивания существенно не отличался во всех группах. Средняя скорость сперматозоидов варьировалась между 91,3 – 100,7 мкм/секунд. Наибольшая скорость движения сперматозоидов зафиксирована в образцах при режиме оттаивания +35 ºС. Отмечена тенденция снижения скорости сразу после оттаивания в зависимости от увеличения температуры водяной бани, разница статистически достоверна (Р<0,001).

Общее число сперматозоидов варьировало между 34 – 37 млн в дозе и соответствовало требованиям ГОСТа 26030-2015 «Сперма быков-замороженная».

После 5-часовой инкубации, согласно визуальной оценке, подвижность сохраняли 28-30% сперматозоидов в полях зрения, тогда в анализаторе SFA-500 данные образцы были оценены на 4-10% выше (при Р<0,001). Мы считаем, что при визуальной оценке оцениваются только сперматозоиды, имеющие прямолинейно-поступательное движение (ППД), а в спермонализаторе при оценке общей подвижности фиксируются все виды движений. В группе быстроподвижных (фертильных) лучший результат 28,7% при средней скорости 102 мкм/сек получен в образцах, где процесс оттаивания проходил при +38 ºС.

Достоверная разница между образцами спермы отмечена спустя 20 часов инкубации Хорошие характеристики имели спермодозы, оттаянные при температурном режиме +38 ºС. Оставались подвижными 23,3% сперматозоидов (микроскопия) и 26,3% оценка в SFA-500, в то же время в других группах подвижность составляла 20% при +35 ºС и +50 ºС, и 18,3% при +70 ºС. Разница достоверна, Р< 0,001.

**Р<0,01 ****Р<0,001

Через сутки после оттаивания и инкубации (табл. 2) лучшие результаты получены в образцах семени, оттаянном при температуре водяной бани +38 ºС. Разница статистически достоверна с высокой степенью вероятности (при Р< 0,001) по всем изученным показателям.

Выявлено, что изначально после деконсервации при разных температурных режимах водяной бани во всех случаях получены сходные результаты, однако при дальнейшей инкубации семени при температуре тела животного в течение 20-24 часов, спермодозы, оттаянные в течение 8-10 секунд при +38 ºС, отличались лучшей сохранностью. Разница по всем изучаемым параметрам статистически достоверна (Р<0,001), что может повысить результативность искусственного осеменения, особенно при поздней овуляции, более 24 часов по отношению к выявленной охоте. Это необходимо учитывать в своей практике специалистам хозяйств.

АО «ГЦВ»
РФ, Московская обл., г. о. Подольск, пос. Быково, ул. Центральная, д.3
тел. +7 (4967) 67-67-22, + 7 (495) 109-99-93, +7 (909) 983-11-33
e-mail: plem@oaohcr.ru 
официальный сайт: www.oaohcr.ru